Пикротоксин-подобные блокаторы ГАМКА-рецепторов Печать


 
R. W. Olsen. Picrotoxin-like channel blockers of GABAA receptors// PNAS  April 18, 2006  vol. 103  no. 16  P. 6081–6082

Пиктротоксин (ПТ) является модельным антагонистом ГАМКА-рецепторов (ГАМКАР), опосредующих основную часть тормозной (быстрой и тонической) нейротрансмиссии в ЦНС. Пикротоксинин (Рис. А.), активное вещество этого растительного конвульсанта, структурно не напоминает ГАМК (небольшую аминокислоту простого строения) и представляет собой полициклическое соединение, не содержащее азотных групп.

PT_GABA_Blocker_001

Это соединение каким-то образом блокирует активируемый ГАМК ток ионов хлора через ГАМКАР. ГАМКАР относятся к суперсемейству лиганд-зависимых ионных каналов. В отличие от конкурентного антагониста ГАМК, бикукуллина, ПТ является неконкурентным антагонистом, действующим не на сайт распознавания ГАМК, а, вероятно, внутри ионного канала. Таким оборазом, ПТ являет собой яркий пример аллостерического модулятора, которые чрезвычайто важны для функционирования белковых структур, и ГАМКАР в частности (1). Достижения последних лет в области структурного моделирования ГАМКАР (Рис В.,С.) согласуются с представлениями о ПТ как о неконкурентом блокаторе хлор-ионного канала (ХИК).

 PT_GABA_Blocker_002PT_GABA_Blocker_003

В недавних метриалах PNAS Chen et al (2) описали, как множество веществ из этой группы, обладающих разнообразными фармакологическими эффектами, могут взаимодействовать с одним и тем же доменом белка ГАМКАР внутри ионного канала.

ПТ имеет интересную историю как препарат и инструмент исследователя. Многие природные и синтетические конвульсанты со свойствами блокаторов ГАМКАР известны тем, что применяются в качестве стимуляторов, конвульсантов, инсектицидов и тд. (3,4). ПТ выделен из растений семейства Menispermaceae, и его близкие «родственники» тутин и кориамиртин из Ново-Зеландского тутового растения Coriaria arborea, известны как «loco weed» - ядовитая для скота трава, вызывавшая случайные отравления животных и людей. ПТ, обладающий свойствами стимулятора и способный вызывать клонико-тонические судороги в отностительно низких дозах, был обозначен в Merck Index в 1970-х как «антидот при передозировке барбитуратами» (5). Показан антагонизм ПТ в отношение ГАМК-ергических тормозных проводящих путей,  и ГАМК-позитивные прапараты, такие как бензодиазепины и барбитураты, нивелируют действие ПТ. ПТ ингибирует in vitro активируемые ГАМК тормозные токи в нейронах и нейро-мышечном аппарате речного рака (4,6). В нейро-мышечном аппарате речного рака и в мозге млекопитающих меченый [3H]дигидропикротоксинин связывается со специфическими сайтами, которые можно определить как ГАМКАР (7).

Casida и Palmer (8) синтезировали и изучили серии мощных синтетических нейротоксичных соединений, которые были названы «cage convulsants» - конвульсанты клеточной структуры. Эти вещества разрабатывались как инсектициды, действующие  на ацетилхолинэстеразу (АХЭ), подобно известному соедининию «малатион». Эти соедниния обладали токсичностью, близкой к ФОС, но не блокировали АХЭ, а действовали на другие мишени в ЦНС. Конвульсанты клеточной структуры являются неконкурентными антагонистами ГАМКАР, действующими на ПТ сайт: они блокируют опосредованные ГАМКАР токи и синапсы в нейронах млекопитающих и ингибируют связывание меченного ПТ с ГАМКАР сайтами в мембранах мозга (7,9). Ярким примером в этом отношении является t-бутилбициклофосфоротионат (TBPS), основной лиганд, используемый в радиолигандных исследованиях ГАМКАР(10).

Экспериментальный конвульстант пентилентетразол (ПТЗ), по-видимому, также действует на хлор-ионный канал ГАМКАР, как и множество полихлорированных углеводородов – инсектицидов, включая диэльдрин, линдан, фипронил. Эти вещества в больших количествах применялись в сельскохозяйственных целях. Некоторые из других мощных токсикантов/пестицидов были мечены радиоактивными изотопами и использовались для изучения работы рецепторов, структурно-функционального анализа действия этого класса соедининений на ГАМКАР как млекопитающих, так и насекомых (2,4,8).  Основным итогом исследования (2) стал вывод о том, что исследованный класс соединений, несмотря на значимые различия в химических структурах, имеет одну молекулярную мешень («рецептор»).

Туйон, компонент масла полыни, обнаруживаемый в напитке «абсент», также действует в области каналов ГАМКАР, как показано Casida и соавторами (11). Абсент, алкогольный напиток, имевший большую популярность среди парижской богемы в конце 19 века, сейчас имеет нелегальный статус из-за своей токсичности. Перефразируя мой предыдущий комментарий (12), как препарат со свойствами токсиканта и судорожного агента может считаться приятным или даже желанным? Туйон, как и ПТ, обладает возбуждающим (аналептическим) действием на ЦНС (а не депрессивным, как каннабиноиды). Препарат подобного рода может вызывать подъем настроения, антидепрессивный, анксиогенный, тревожный эффект и обладать антагонистическим действием в отношение  анксиолитического, седативного и амнестического эффектов ГАМК-позитивных препаратов (таких, как бензодиазепины и этанол) (1). Не следует, однако забывать, что в абсенте сбалансированы возбуждающие эффекты туйона и депримирующие этанола.

Другим важным шагом в определнии связи ПТ-подобных неконкурентых антагонистов и ГАМКАР было независимое определние сайта действия инсектецидов типа диэльдрина. В добавление к тому, что Casida и Palmer (8) показали способность многих инсектицидов тормозить связывание меченного [35S]TBPS с синаптосомами головного мозга животных (и способность блокировать ГАМКАР), гомологичный ген ГАМКАР насекомых был клонирован с использованием диэльдрин-устойчивых мух Musca domestica в качестве скринингового тест-объекта. Сравнение чувствительных и устойчивых животных привело к идентификации Rdl гена у дрозофил, который у насекомых оказался гомологом β-субъединицы ГАМКАР млекопитающих (13). Мутация, сообщающая нечувствительность к диэльдрину (который, как и ПТ, является неконкурентным антагонистом ГАМКАР), отностится к A2’S остатку TM2 домена/ионного канала Rdl субъединицы ГАМКАР и необходима для связывания [35S]TBPS (14-18). Как показано Chen et al. (2), этот аминокислотный остаток и другие внутри канала на цитоплазматическом конце (N-терминаль) аминокислотной последовательности белка (Рис С.) входят в состав сайта связывания диэльдрина, ПТ и других токсикантов и инсектицидов из группы неконкурентных антагонистов ГАМКАР. Важным доказательством участия данного домена (аминокислот в стенке ионного канала TM2) в контактном (ковалентном?), а не конформационном, связывании неконкурентных антагонистов стала демонстрация того, что affinity-labeled сульфгидрильные реагенты, основанные на струкруре фипронила, ковалентно связывались с цистеином (мутация) в положении 2’ (V257) в TM2 α1-субъединицы ГАМКАР (17). Структурное моделирование и анализ, произведнные Chen et al. (2), особенно важны для исследований суперсемейства лиганд-зависимых ионных каналов, структуры которых не были определены при помощи рентгеновской кристаллографии (рентгенструктурного анализа?). Данные рентгенструктурного анализа на ацетилхолин-связывающем белке улитки (19), представляющем собой гомопентамерную структуру, связывающую АХ, не только выявили структурную гомологию иследуемого белка и никотинового холинорецептора (Н-ХР), но и подтвердила взаимное расположение субъединиц и расположение «карманов» связывания агонистов и антагонистов: аминокислоты, составляющие сайты связывания, были идентифицированы на внеклеточных доменах на поверхности субъединиц при помощи методов affinity-labeling и мутагенеза (20-22). Гомологичные полипептидные цепи участвуют в формировании «карманов» связывания лигандов на ГАМКАР. ГАМКАР содержат аллостерические «карманы» во внеклеточном домене, включая модифицированные сайт агонистов на наружней (? interfaces) поверхности субъединиц для БД (бензодиазепинов) и , возможно, этанола (1,14,15,23).

Структуры трансмембранных доменов α-спирали этого суперсемейства рецепторов еще предстоит изучить на атомном уровне, но ЭВМ-анализ криоэлектронных микрофотографий Н-ХР Torpedo (24) позволил получть структуры с разрешением 4-Å. Такое приближение соответствует уже имеющимся биохимическим данным (доказательствам):

  1. Неконкурентные антагонисты Н-ХР присоединяются к остаткам в TM2 (20-22)
  2. cysteine scanning accessibility mutagenesis показывает, что те остатки, которые считают находящимися в канале на внешней стороне (в просвете канала?) α-спирали TM2 доступны действию растворителя, тогда как аминокислотные остатки на внутриенней стороне спирали – не доступные (21,25). Данные, полученные в экспериментах по блоктированию канала, соответствуют с представлениями о поре, сформированной пятью доменами TM2 гетеропентамерного протеина. Эти АМК остатки (2’,6’,9’ и тд – Рис С.) включают остатки, определяющие размер поры (препятствие ионному току в середине поры – L9’), и сайт действия неконкурентных антагонистов (НКА) (действия, включая связывание – таким обазом, это вероятно и есть реальные сайты связывания НКА) (2,17,18,23)
  3. Остатки в TM2 способны влиять на чувствительность к агонистам и вероятность открытия канала (14,20-23), что определяется наличием аллостерической связи этих доменов с механизмами функциональной активации рецептора.

Все данные, полученные на Н-ХР, справедливы и для других представителей этого суперсемейства (включая ГАМКАР). Таким образом, TM2 домен присутствует в ГАМКАР и механизм действия ПТ-подобных НКА признается многими авторами как прямое блокирование канала. АМК остатки, вовлеченные в действие НКА, находятся в TM2 и соответствуют сайтам связывания этих лигандов.

Трансмембранный домен ГАМКАР и «родственных» представителей суперсемейства (как, например, глициновые рецепторы) является мишенью общих ингаляционных анестетиков  (изофлуран), высоких доз этанола (более 100 mM) (26), внутривенных анестеттиков этомидата и пропофола (27). По-видимому, анестетики связываются с заполненным водой (water-fiiled) “карманом”, образованным пронизывающими мембрану спиралями не внутри, а с наружней стороны поры (26). Модель Chen et al. (2) сайта НКА внутри канала ГАМКАР основана на β3-гомопентамерном рецепторе, обладающим высоким сродством к НКА, напоминающим канал насекомых, и симментрия протеина (гомомерность) облегчает моделировнаие и позиционирование лигандов. Данная модель приводит нас к новому заключению о  том, что различные НКА с различной химической структурой связываются с одним и тем же сайтом в 8,5-Å поре и блокируют канал, взаимодействуя с одними и теми же аминокислотными остатками TM2  в положении A2’,T6’,L9’ (Рис С.), интересный подход!

Однако же, нативные ГАМКАР млекопитающих не гомомерны и отличаются от β3-гомомера тем, что присутствие дополнительных субъединиц изменяет чувствительность (профиль структура-активность) рецепторов к НКА (гетеромерные рецепторы имеют свои особенности функционирование канала (channel gating) и  аллостерических взаимодействий между сайтами других модуляторов и НКА). Сегодня ПТ-подобные НКА ГАМКАР по-прежнему остаются интересными препаратами.

 

Литература.

1. Martin, D. L. & Olsen, R. W., eds. (2000) GABA in the Nervous System (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia).

2. Chen, L., Durkin, K. A. & Casida, J. E. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 5185–5190.

3. Porter, L. A. (1967) Chem. Rev. (Washington,DC), 441–464.

4. Olsen, R. W. & Gordey, M. (2000) in Handbook of Experimental Pharmacology, Pharmacology of Ionic Channel Function: Activators and Inhibitors, eds.

Endo, M., Kurachi, Y. & Mishina, M. (Springer, Heidelberg), Vol. 147, pp. 497–515.

5. Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y. & Fertig, M. N., eds. (1976) The Merck Index (Merck, Rahway, NJ), 9th Ed.

6. Takeuchi, A. & Takeuchi, N. (1969) J. Physiol. (London) 205, 377–391.

7. Ticku, M. K. & Olsen, R. W. (1979) Neuropharmacology 18, 315–318.

8. Casida, J. E. & Palmer, C. J. (1988) Adv. Biochem. Psychopharm. 45, 109–123.

9. Bowery, N. G., Collins, J. F. & Hill, R. G. (1976) Nature 261, 601–603.

10. Squires, R. F., Casida, J. E., Richardson, M. & Saederup, E. (1983) Mol. Pharmacol. 23, 326–336.

11. Hold, K. M., Sirisoma, S. I., Ikeda, T., Narahashi, T. & Casida, J. E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3286–3291.

12. Olsen, R. W. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4417–4418.

13. ffrench-Constant, R. H., Steichen, J. C., Rocheleau, T. A., Aronstein, K. & Roush, R. T. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1957–1961.

14. Olsen, R. W., Chang, C.-S. S., Li, G., Hanchar, H. J.

& Wallner, M. (2004) Biochem. Pharmacol. 68, 1675– 1684.

15. Sigel, E. (2002) Curr. Top. Med. Chem. 2, 833–840.

16. Xu, M., Covey, D. F. & Akabas, M. H. (1995) Biophys. J. 69, 1858–1867.

17. Perret, P., Sarda, X., Wolff, M., Wu, T. T., Bushey, D.& Goeldner, M. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25350– 25354.

18. Jursky, F., Fuchs, K., Buhr, A., Tretter, V., Sigel, E. & Sieghart, W. (2000) J. Neurochem. 74, 1310–1316.

19. Brejc, K., van Dijk, W. J., Klaassen, R. V., Schuurmans, M., van der Oost, J., Smit, A. B. & Sixma, T. K. (2001) Nature 411, 269–276.

20. Corringer, P.-J. LeNovere, N. & Changeux, J.-P. (2000)

Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, 431–458. 21. Karlin, A. (2002) Nat. Rev. Neurosci. 3, 102–114.

22. Chiara, D. C., Trinidad, J. C., Wang, D., Ziebell, M. R., Sullivan, D. & Cohen, J. B. (2003) Biochemistry 42, 271–283.

23. Chang, Y. & Weiss, D. S. (2000) in GABA in the Nervous System, eds. Martin, D. L. & Olsen, R. W. (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia), pp. 127–139.

24. Miyazawa, A., Fujiyoshi, Y. & Unwin, N. (2003) Nature 423, 949–958.

25. Horenstein, J., Wagner, D. A., Czajkowski, C. & Akabas, M. H. (2001) Nat. Neurosci. 4, 477–485.

26. Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R. & Harris, R. A. (2001) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41, 23–51.

27. Rudolph, U. & Mohler, H. (2004) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 475–498.

 
Яндекс.Метрика
Яндекс цитирования